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熒光定量服務(wù)


熒光定量PCR的基本原理就是在PCR擴(kuò)增過程中，隨著PCR循環(huán)數(shù)的遞增，PCR產(chǎn)物不斷積累，熒光信號(hào)也會(huì)相應(yīng)的增加，這樣就可以通過熒光強(qiáng)度的變化來對(duì)PCR反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)的監(jiān)測(cè)，并以b-Actin或GAPDH等管架基因作為內(nèi)參照，對(duì)目的基因的表達(dá)量進(jìn)行半定量檢測(cè)。

科佰生物將根據(jù)您的科研需求可以提供SYBR Green染料法和TaqMan探針法。通過對(duì)DNA或RNA的熒光定量PCR監(jiān)測(cè), 實(shí)現(xiàn)基因的相對(duì)定量、定量和定性分析。

SYBR Green熒光染料法：適用于任何DNA，無需設(shè)計(jì)探針，采取雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法，實(shí)驗(yàn)周期短，結(jié)果重復(fù)性好，靈敏度高。

TaqMan熒光探針法：經(jīng)驗(yàn)豐富的實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員設(shè)計(jì)探針，對(duì)目標(biāo)基因有高特異性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，相對(duì)于SYBR Green法，靈敏度更高。

1.定量：

定量首先必須構(gòu)建與檢測(cè)樣品目的基因具有相同序列的標(biāo)準(zhǔn)品。使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制作3個(gè)點(diǎn)以上的標(biāo)準(zhǔn)曲線后，可以使用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知濃度的檢測(cè)樣品進(jìn)行量（起始拷貝數(shù)）分析。

2.相對(duì)定量（mRNA表達(dá)量分析）：

基因表達(dá)的研究一般采用相對(duì)定量的方法。相對(duì)定量法必須對(duì)樣品的目的基因和參比基因內(nèi)標(biāo)同時(shí)分別進(jìn)行定量，然后求出對(duì)于參比基因的目的基因的相對(duì)量。通過對(duì)樣品間的目的基因的相對(duì)量進(jìn)行比較，可以對(duì)不同樣品間的mRNA進(jìn)行表達(dá)量分析。參比基因通常選用表達(dá)量相對(duì)恒定的House Keeping Gene，如：GAPDH、b-actin等。通過同時(shí)對(duì)參比基因的實(shí)時(shí)檢測(cè)，可以對(duì)樣品之間由于起始細(xì)胞數(shù)不同、或RNA提取效率的不同等造成的RNA量誤差進(jìn)行校正，達(dá)到在嚴(yán)格意義上對(duì)樣品之間的mRNA表達(dá)量進(jìn)行分析之目的。

1、總 RNA 提取及定量；

2、PCR 引物設(shè)計(jì)及反轉(zhuǎn)錄；

3、熒光引物設(shè)計(jì)（SYBR Green 熒光染料法）/探針設(shè)計(jì)（TaqMan 熒光探針法)；

4、熒光定量PCR，進(jìn)行擴(kuò)增曲線、溶解曲線、表達(dá)量差異分析等實(shí)驗(yàn)；

5、數(shù)據(jù)分析與處理；

6、完整實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

樣品要求：

1.樣品可提供組織、細(xì)胞、RNA、cDNA中的一種,對(duì)于提供樣本的大致原則如下：組織樣本,盡可能提供2×2×2mm3體積或以上,新鮮組織可直接提供，不需處理；對(duì)于細(xì)胞樣本，盡可能提供3×10^6個(gè)細(xì)胞左右,加適量Trizol處理即可，確保樣品適于RNA抽提。RNA、cDNA含量根據(jù)同等細(xì)胞數(shù)量的細(xì)胞抽提和逆轉(zhuǎn)錄大致界定, 如果提供RNA或cDNA我們要對(duì)您提供的材料進(jìn)行評(píng)估。

2.客戶提供盡可能詳細(xì)的背景信息；物種信息，擴(kuò)增目的基因的NCBI登錄號(hào)等。

3.運(yùn)輸要求，液氮或干冰保存寄送。

注：樣本應(yīng)避免各類污染和反復(fù)凍融。

提交的產(chǎn)品和資料：

1.RNA濃度及熒光定量PCR原始數(shù)據(jù)及分析結(jié)果；

2.熒光定量PCR完整的實(shí)驗(yàn)步驟、使用儀器、軟件設(shè)置參數(shù)等。